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常規(guī)普通PCR常見(jiàn)問(wèn)題

更新時(shí)間:2022-07-04瀏覽:1759次
1.瓊脂糖凝膠電泳后無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶  
主要表現(xiàn):Marker及對(duì)照條帶均正常,但檢測(cè)樣本無(wú)條帶。  
原因分析:1.反應(yīng)條件不合適:PCR過(guò)程中退火溫度過(guò)高,退火延伸時(shí)間不足,反應(yīng)循環(huán)數(shù)過(guò)少。  
2.核酸模板濃度或純度低:普通PCR的檢測(cè)敏感度有限,樣本核酸含量低或者含有抑制物。  
3.反應(yīng)體系與核酸擴(kuò)增不匹配:檢測(cè)體系中的Mg2+濃度,dNTPs量或Buffer與目標(biāo)核酸擴(kuò)增所需條件不匹配。  
4.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解:存在引物二聚體或二級(jí)結(jié)構(gòu),引物稀釋后未分裝儲(chǔ)存條件不適宜或者反復(fù)凍融次數(shù)過(guò)多。  
解決方案:1.優(yōu)化反應(yīng)條件,梯度摸索退火溫度,延長(zhǎng)退火延伸時(shí)間,增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)(30-45區(qū)間為宜)。  
2.對(duì)核酸模板進(jìn)行純化,或使用商業(yè)化核酸提取試劑盒進(jìn)行提取,增加核酸模板的上樣量。  
3.優(yōu)化反應(yīng)體系(預(yù)混體系除外),改變檢測(cè)體系中的Mg2+濃度及dNTPs用量,更換體系中Buffer。  
4.重新設(shè)計(jì)引物,避免引物二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu),在一次稀釋引物后可分裝成多支小管,減少反復(fù)凍融次數(shù)。

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